賽默飛無(wú)氯仿提取RNA解決方案來(lái)了！
TRIzol試劑 1977年，科學(xué)*** Axel Ullrich 和他的同事們提出使用異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）用于 RNA 的分離純化，至1990 年，優(yōu)化該方法后，推出商業(yè)化的 TRIzol 試劑。
賽默飛TRIzol試劑是***種即用型試劑，用于在1小時(shí)內(nèi)從人類(lèi)、動(dòng)物、植物、酵母或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞和組織樣本中提取高質(zhì)量的總RNA（以及DNA和蛋白質(zhì)），TRIzol試劑在樣本勻漿化時(shí)，可以破壞細(xì)胞，溶解細(xì)胞組分，同時(shí)高效的抑制RNA酶的活性，從而維持RNA的完整性。 TRIzol無(wú)氯仿解決方案 由于在TRIzol試劑的提取過(guò)程中，需要使用氯仿，而氯仿具有揮發(fā)性，會(huì)對(duì)眼睛、呼吸道、皮膚和黏膜造成刺激，因此迫切需要***種無(wú)氯仿解決方案。經(jīng)過(guò)賽默飛科學(xué)***的不懈探索，發(fā)現(xiàn)了1-溴-3-氯丙烷（1-Bromo-3-chloropropane ，BCP）可以替代氯仿，搭配TRIzol試劑提取RNA，接下來(lái)，小編就和大******睹為快——TRIzol無(wú)氯仿提取RNA的效果。 操作流程 在樣本進(jìn)行勻漿化時(shí)，加入0.2mL氯仿或者0.1mL BCP，進(jìn)行RNA提取。 圖1. 操作流程示意圖，詳細(xì)步驟如下： 加1mL TRIzol試劑，裂解樣本，室溫孵育5min。 加0.2 mL氯仿或 0.1 mL BCP，振蕩混勻，孵育3min。 在4°C下12000×g離心樣本15min。 取約500μL上清液至新樣本管中。 加等樣本體積的異丙醇，顛倒混勻，在4°C下孵育10min。 在4°C下12000×g離心10min，棄上清。 加1mL 75%乙醇，重懸沉淀，短暫渦旋樣本，在4°C下7500×g離心5min，棄上清液。此步驟重復(fù)***次。 干燥5-10min，加20-50μL RNase-Free水，在55°C的水浴孵育10min。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別使用氯仿和BCP對(duì)5mg和20mg的兔的肝臟和腦組織，按照TRIzol試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)得到的RNA產(chǎn)物進(jìn)行含量、純度、完整性等進(jìn)行評(píng)估。 RNA含量和純度 圖2. Nanodrop檢測(cè)RNA的產(chǎn)量和純度 RNA完整性測(cè)定 圖3. Agilent 2100測(cè)定RNA完整性和計(jì)算RIN指標(biāo) RT-qPCR分析 圖4. 對(duì)提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)內(nèi)參基因：GAPDH和ACTA2，說(shuō)明BCP提取的RNA，與氯仿相比，內(nèi)參基因表達(dá)量無(wú)顯著差異。 圖5. 提取RNA進(jìn)行Xeno抑制性實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明，BCP和氯仿所提取出來(lái)的RNA不會(huì)擴(kuò)增抑制后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，降低假陰性結(jié)果的可能性，確保RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確和可控的，再次佐證了可以使用BCP搭配TRIzol試劑使用。 小結(jié) 在有機(jī)法提取RNA的過(guò)程中，賽默飛無(wú)氯仿提取后的RNA，含量高，純度好，完整性指數(shù)高，可直接做后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
